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Microtableaux ADN

Département de biologie moléculaire végétale
Université de Lausanne
Faculté de biologie et médecine
Biophore
CH-1015 Lausanne

Tél.: ++41 021 692 41 90
Fax: ++41 021 692 41 95

Présentation

Collaborateurs

Le Groupe de recherche dirigé par le Professeur Edward E. Farmer est composé des collaborateurs suivants: Dr Philippe Reymond, Dr Hans Weber, Dr Pauline Bariola, Dr Sabine Vollenweider, Dorota Retelska, Stéphanie Cluzet, Emmanuelle Almeira, Stéphanie Stolz, Aurore Chételat, Martine Damond, Robin Liechti.

Objectifs

Tous les organismes vivants contiennent des gènes dont l’activité détermine, dans une large mesure, ce qu’il sont et et ce qu'ils font. Les gènes sont des séquences ou codes à base d’ADN localisés dans les chromosomes. Les organismes les plus simples contiennent déjà des centaines de gènes; les plus complexes tels que les plantes à fleurs en comportent des milliers; quant à l’être humain, il compterait, selon les estimations des scientifiques, entre 50'000 et 80'000 gènes différents. Chacun de ces gènes a une ou plusieurs fonctions dans l'organisme. Certains sont, par exemple, impliqués dans le développement, la croissance et le fonctionnement des yeux tandis que d'autres jouent un rôle dans la reproduction ou le mouvement.

Le Groupe de biologie et physiologie végétales (BPV) travaille sur les plantes à fleurs et plus particulièrement sur l'une des plus simples d’entre elles, la fausse arabette (Arabidopsis thaliana). Renfermant environ 20'000 gènes, cette plante a été choisie d’une part, car elle se cultive facilement et d’autre part, car la séquence de son ADN est presque entièrement connue. Chez elle, comme chez les autres plantes, certains gènes contrôlent la production des feuilles, des racines et des fleurs; d'autres dirigent d'importants processus métaboliques tels que la photosynthèse et la synthèse d'amidon; d’autres encore sont impliqués dans le système de défense.

Les molécules messagères ARN

La plupart des gènes, aussi bien chez les humains que chez les plantes, ne sont actifs qu'à certains moments. Ainsi lorsque nous nous coupons (ou qu’une plante est blessée par un insecte), certains gènes sont activés afin de nous protéger contre les micro-organismes opportunistes et de favoriser le processus de cicatrisation.

Pour fonctionner, le code ADN des gènes est tout d'abord copié par la cellule en une molécule messagère appelée ARN. Au contraire de l’ADN, cette molécule est instable et sa présence dans une cellule indique les gènes actifs. Chaque type d’ARN messager est unique pour chaque gène, ainsi il est facile d'imaginer les constants changements au sein de cette immense et complexe population de molécules. L'information contenue dans l’ARN messager est décodée et utilisée pour diriger la synthèse des protéines. L'activité des gènes est mesurable de plusieurs manières, la plus simple consistant à mesurer la population d’ARN messagers dans une cellule.

Traditionnellement, on mesure l'activité d'un seul gène ou d'un petit nombre de gènes. Toutefois, ceci ne nous donne pas une information complète sur l'organisme. C'est un peu comme si l’on essayait de comprendre le fonctionnement d’une armée en n'observant que les pilotes d'hélicoptères et les opérateurs radio. Idéalement, il faudrait pouvoir considérer l'ensemble des éléments composant l’armée (soldats, généraux, pilotes, secrétaires, responsables de l'intendance, conducteurs, médecins, etc...). C'est ce qui se passe actuellement en biologie. Au lieu d'étudier le comportement de gènes isolés, nous sommes maintenant en mesure d'étudier simultanément l'activité de centaines ou de milliers de gènes. La révolution qui a permis ce développement est la "génomique".

La génomique est la science de la compréhension du génome (ensemble des chromosomes d'une cellule) et de la fonction de tous les gènes qu'il contient. Une fois connue la séquence chimique de l’ADN, il est possible d’utiliser cette information pour comprendre la fonction des gènes à l'intérieur de l’ADN.

Les molécules messagères ARN

Pour étudier l'activité des gènes, le Groupe BPV recourt à une méthode de génomique fondée sur la mesure de leur ARN. Cette méthode est connue sous le nom de "microtableaux d’ADN" et fut inventée en 1995 à l'Université de Standford, aux USA. Le Dr Philippe Reymond s'est rendu à Standford en 1997 afin de se former à l’utilisation de cette méthode et, dès son retour, il a développé les microtableaux d’ADN à Lausanne avec l'aide de Martine Damond et, récemment, de Venkatesh Krishnamurthy. Emmanuelle Almeras, Stéphanie Cluzet, Robin Liechti et Dorota Retelska, qui préparent leur thèse de doctorat, ont également été initiés à cette technique et l'utilisent dans leur recherche.

De nombreux laboratoires collaborent à la production d'une collection de gènes caractéristiques d'un organisme particulier. Ainsi on a actuellement accès à environ 10'000 gènes de la fausse arabette. Utilisés comme sondes, ils permettent d’étudier l’activité des gènes dans la plante vivante grâce à la technique de microtableaux d’ADN.

Etudier l'activité des gènes dans les organismes vivants

Dans un premier temps, des gènes individuels sont déposés sur une lame de verre. On peut choisir de déposer des centaines ou des milliers de gènes les uns à côté des autres sur la lame. Afin d’assurer un dépôt de bonne qualité, on recourt à un robot. De faibles quantités de chaque gène sont déposées et liées chimiquement à un endroit défini sur la lame. Ceci fait, la lame permet d’estimer l'activité des gènes.

La technique des "microtableaux d'ADN" fonctionne parce que les ARN messagers peuvent être modifiés par l'adjonction d'un marqueur fluorescent. On extrait l’ARN des tissus que l’on désire examiner. En principe, on obtient un mélange complexe contenant des milliers d’ARN. Si un gène est très actif, son ARN correspondant sera très abondant, c'est-à-dire présent sous forme de nombreuses copies. Si un gène est inactif, il y aura peu ou pas de copies de l’ARN correspondant.

Nous prenons la solution d’ARN fluorescent et la disposons sur le microtableau. Les molécules fluorescentes vont se placer chacune sur le point du microtableau qui contient le gène correspondant. La molécule fluorescente préparée par le gène A ne va se fixer que sur le point représentant le gène A et non sur les points représentant les gènes B, C ou D. La solution de molécules fluorescentes préparée à partir de l'extrait de feuilles est très complexe et contient des milliers de molécules différentes. Chacune d'entre elles se fixe alors sur le point correspondant et lui seul.

Lorsque nous plaçons le microtableau sous un microscope et que nous l'irradions, nous voyons chaque point s'illuminer. Un point émettant une lumière vive signifie que le gène est très actif. Si un autre point n'émet rien, cela signifie que le gène n'était pas actif au moment où la feuille a été récoltée. Ainsi, peut-on voir comment 10'000 gènes se comportent en une seule fois !

Les résultats de l'étude de l'activité d'un petit groupe de gène apparaissent dans la figure 1. L'image représente des points d’ADN d'un diamètre d'environ 100 µm. Chaque point contient un gène différent et seule une très faible quantité d’ADN (3-5 ng) est déposée par le robot. L'analyse des résultats par ordinateur permet de représenter chaque gène par une tache colorée. Les taches rouges indiquent des gènes très actifs, les taches vertes ceux qui ont été inactivés et les taches jaunes indiquent des gènes qui n'ont pas été modifiés par les traitements appliqués. Ainsi, la vision des points lumineux sur le microtableau nous permet de voir quels sont les gènes actifs et comment ce type d'activité se modifie avec le temps.

Cette méthode offre de multiples champs d'applications. On peut, par exemple, observer les changements d'activité des gènes liés au vieillissement ou à la maladie, étudier le comportement des gènes humains lors de la grippe, surveiller l'activité des gènes pendant le développement d'une souris ou d'une mouche ou encore examiner la manière dont les plantes répondent lorsqu'elles sont attaquées par des insectes ou des pathogènes.

Pour avoir une vision plus précise de la façon dont les gènes sont activés lorsqu'une plante est attaquée, nous mesurons l'activité des gènes à des temps différents. Ceci est illustré par la figure 2 où l’on voit des carrés rouges et verts. Les carrés rouges indiquent des gènes activés lorsqu'une feuille de fausse arabette est blessée, les carrés verts correspondent à des gènes inactivés après la blessure.

Aujourd’hui, nous savons que les réponses de défense des plantes sont plus complexes qu'on ne l'imaginait. On a ainsi identifié avec succès le gène activé lorsqu'un insecte attaque la plante, mais pas lorsque celle-ci est blessée physiquement. Ceci signifie que la fausse arabette est non seulement capable de détecter la présence d'un insecte, mais encore de distinguer l'attaque d’un insecte d'une blessure physique.

Ces résultats aideront à comprendre les mécanismes de défense des plantes; par ailleurs, ils pourraient apporter de précieuses informations pour le développement de nouvelles stratégies agricoles permettant de diminuer le recours aux insecticides et, partant, les dommages causés à l'environnement.

Plus généralement, la technique des microbleaux d’ADN est largement applicable en biologie et a déjà fourni de nouvelles informations essentielles à beaucoup de domaines de recherche, y compris la biologie du cancer.

Cette technique suscite un vif intérêt et de nombreux chercheurs, aussi bien lausannois que genevois, participent aux réunions mensuelles du "Chips Club" qui se tiennent au Bâtiment de biologie, le dernier mercredi du mois, à 16h30 (salle 4401). Ces réunions, initiées avec l'aide du Dr Otto Hagenbüchle de l'Institut suisse de recherches expérimentales sur le cancer (ISREC), permettent la discussion des tout derniers développements de cette méthode.

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